Studying the Role of Microglia in Neurodegeneratio

更新时间: 2019-08-11

  预备视神经,将其嵌入冷冻组织的包埋介质中,并如前所述进行14μm冷冻切片(Hilla et al。,2017; Leibinger et al。,2017) 。

  为避免PLX5622降解,必需连结食物干燥,并正在中插手少量( ca。 20克/动物)。

  要阐发两个分歧组之间的数据,请利用双向ANOVA,此中单个组做为第一个变量,距离病变部位的距离做为第二个变量。

  一个合适的过后查验供给了相关群体之间的严沉差别的消息,别的,还供给了到病变部位的单一距离的光鲜明显差别。

  视神经挤压后19天反复步调B1-B3以确保正在玻璃体内打针2μl顺行示踪剂CTB(5μg/μl)之前的最佳手术前提。

  环节字:轴突再生, 神经退变, 小胶质细胞, 小胶质细胞去除, PLX5622, CSF1R

  为了可视化Iba1阳性小胶质细胞和耗竭效率,能够按照所述方案(视频1和视频2)用正在封锁溶液中稀释的1:1,000 Iba1一抗配合染色视网膜。

  21天后,能够收成各自的组织以阐发耗尽效率(图3A和3B)。不然,正在尝试期间将小鼠放正在PLX5622-chow上以确连结续的小胶质细胞耗尽。当用剂医治至多8周时,小鼠不会呈现任何可察看到的表型。

  用含有PLX5622的食物互换啮齿动物食物并供给至多21天的小鼠随便拜候,以确保最大的耗损效率(图1A,2A和3D)。各对照小鼠接管尺度AIN-76A啮齿动物饲料,不含CSF1R剂PLX5622。

  CSF1R剂PLX5622由Plexxikon Inc.以尺度AIN-76A啮齿动物饲料配制,浓度为1,200 mg / kg。

  将视网膜取第一抗体(βIII-微管卵白[1:1,000]或具有多个剪接的RNA连系卵白[RBPMS,1:500])一路孵育,正在4℃下正在湿化室中正在封锁溶液中稀释留宿。

  RGC轴突凡是仅显示很是无限的再生能力,可是能够通过RGC的再生形态来改善再生成果,例如通过炎性刺激或供给细胞因子(Fischer 等人,,2000)。 ; Leibinger et al。,2016)。

  图3. PLX对CNS组织中Iba1阳性小胶质细胞的耗损效率A.来自对照小鼠的老练视网膜全体上的最大强度投影共聚焦图像显示整个视网膜及其分歧层中的Iba1阳性小胶质细胞。左下方的放大显示神经节细胞层中的小胶质细胞。相反,PLX处置的小鼠正在所有视网膜层中缺乏小胶质细胞,导致100%的耗损效率(也拜见视频2)。比例尺= 1毫米。 B.Iba1阳性小胶质细胞正在老练视神经中平均分布,而PLX使用导致大量小胶质细胞耗竭。取视网膜相反,视神经中偶尔会呈现一些小胶质细胞(Hilla et al。,2017)。比例尺=100μm。 C.视神经挤压后21天,Iba1阳性细胞正在对照小鼠以及小胶质细胞耗尽小鼠(PLX)的毁伤部位储蓄积累,而PLX视神经的其余部门连结缺乏信号。如其他处所所阐发的,这些残剩的细胞很可能是浸湿的制血巨噬细胞(Hilla et al。,2017)。比例尺=100μm。 D.共聚焦图像显示,PLX的导致Iba1阳性小胶质细胞从头填充视网膜,强调了持续PLX医治无效小胶质细胞耗竭的需要性。左下方的框显示了概览中区域的神经节细胞层的放大倍数。比例尺= 1毫米。

  凡是,可能需要高时间以清晰地视神经远端部门中的单个再生CTB阳性轴突。因为正在毁伤部位的轴突数量相当高,正在宽视场显微镜中的高时间可能导致荧光信号散射到视神经的远端部门。这可能因而将病变部位的假定挪动到视神经的远端部门。因为这将导致正在到病变部位的分歧距离处的再生轴突的不准确量化,可能需要正在较低时间的病变部位的图像以清晰地识别病变部位。

  一些研究曾经颁发,表白小胶质细胞对RGC存活和轴突再生的晦气影响,而其他研究表白无益的神经感化(Thanos et al。,1993; Levkovitch-Verbin et al。 ,2006; Bosco et al。,2008; Chen et al。,2012; Rice et al。,2015)。然而,因为缺乏耗尽方式,很多研究最后通过药理学方式改变了它们的活化形态,阐发了小胶质细胞的感化(Thanos et al。,1993; Levkovitch-Verbin et al。 ,2006; Bosco et al。,2008; Jiao et al。,2014)。近年来,开辟了遗传方式以实现小胶质细胞耗竭(Heppner et al。,2005; Bruttger et al。,2015; Waisman et al。,2015)。然而,除了转基因动物的需要之外,这些方式具有潜正在的错误谬误,例如星形胶质细胞增生的成长,促炎细胞因子的排泄和血脑樊篱毁伤,这使数据注释复杂化。曲到比来,药物集落刺激因子1受体(CSF1R)剂PLX3397和PLX5622才得以开辟,其答应CNS中小胶质细胞几乎完全耗尽,而取动物遗传布景无关(Elmore et al。,2014 ; Spangenberg et al。,2016; Hilla et al。,2017)。现实上,我们比来证明口服PLX5622医治21天导致视网膜中小胶质细胞完全耗损,几乎完全消弭了视神经(Hilla et al。,2017)。按照以前的研究,这种方式通过CSF1R选择性地小胶质细胞凋亡,而其他细胞如外周巨噬细胞不受影响(Elmore et al。,2014; Hilla et al。 ,2017)。虽然有些研究表白这种医治会导致大脑中星形胶质细胞的细小勾当,但我们正在视神经或视网膜中没有发觉任何勾当(Elmore et al。,2014; Hilla et al。,2017)。此外,因为剂具有口服生物可操纵性而且可以或许通过血脑樊篱,因而PLX5622可配制正在尺度啮齿动物食物中,从而无需按期打针。因而,这种方式使科学家可以或许明白地处理小胶质细胞对分歧病CNS典范的感化,例如毁伤或慢性疾病,不只正在视觉系统中,并且正在其他凸起的CNS组织如脑和脊髓中。正在视觉通中利用这种方式,我们发觉小胶质细胞既不影响RGC的退化过程,也不影响它们正在急性毁伤时再生受损轴突进入视神经的能力(Hilla et al。,2017)。目前的方案描述了视觉系统中消弭小胶质细胞的方式,以及若何量化对视神经中RGC急性变性和轴突再生的影响,以确定小胶质细胞正在这种环境下的贡献。该方案能够很容易地扩展到查询拜访小胶质细胞参取视觉系统中的急性和慢性毁伤或疾病的其他典范。

  【布景】 小胶质细胞是中枢神经系统(CNS)的常驻免疫细胞,其持续扫描其以进行病理改变(Nimmerjahn et al。,2005)。正在检测到这种环境后,小胶质细胞改变为活化形态并向其进行分歧使命的来历迁徙(Kreutzberg,1996; Davalos et al。,2005)。病理改变,例如神经退行性疾病或急性毁伤,取活化的小胶质细胞的神经元丢失和这些细胞的感化相关。因而,总体假设是小胶质细胞参取该过程(Thanos,1991; Davalos et al。,2005; Hanisch和Kettenmann,2007)。除小胶质细胞对神经元的可能影响外,小胶质细胞也是胶质瘢痕的一部门,胶质瘢痕正在毁伤部位构成并损害CNS中的轴突再生(Silver,2004; Kitayama et al。, 2011)。然而,因为较着区分受损神经中浸湿的血液中存正在的巨噬细胞和小胶质细胞是不成行的,小胶质细胞正在胶质瘢痕构成和轴突再生中的特定感化仍然难以捉摸(Silver,2004; Hanisch和Kettenmann,2007; Prinz和Priller, 2014; Hilla et al。,2017)。

  仅包罗来自完整视神经的切片,此中毁伤部位之间的组织和最长再生轴突之后1mm的组织未被。

  相关眶内视神经挤压和玻璃体内打针的更细致看法能够正在其他处所找到(Chiu et al。,2007; Magharious et al。,2011)。

  图2.视网膜全体制备和视神经毁伤后神经元存活的阐发。A.通过PLX5622(CSF1R剂)起头尝试的时间线。然后,对小鼠进行手术,并正在21天后处死,以量化视神经毁伤后的视网膜神经节细胞存活。 B.没有角膜和晶状体的去核眼的示企图显示了视网膜中的径向暗语的以实现三叶草外形。 C.单个视网膜象限的放大注释了图像采集以量化神经元存活。图像记实从乳头(半圆)起头大约1毫米处而且前进到视网膜外部,而图像之间没有堆叠。 D.视神经毁伤后21天视网膜神经节细胞层的示例性共聚焦图像。 RBPMS染色(绿色)显示RGC somata,而βIII-微管卵白(品红色)别的凸起RGC轴突。底部的归并图片暗示两个RGC标识表记标帜之间的高堆叠。比例尺=50μm。

  正在PLX5622上饮食14-21天后,视网膜的耗损效率为100%,而且具有高度可反复性。然而,正在其他CNS组织中,可能残留一些小胶质细胞。若是还阐发其他CNS组织的耗竭效率,则视网膜能够用做阳性对照。

  正在麻醉不完全的环境下,正在手术期间,小鼠应正在1%/ 99%O 2 下接管额外的异氟醚麻醉。

  图1.视神经毁伤和轴突再生的尝试安拆。:一种。通过PLX5622(CSF1R-剂)起头尝试的时间表。然后对小鼠进行手术,而且正在处死前两天,通过玻璃体内霍乱毒素亚单元B(CTB)打针对视网膜神经节细胞轴突进行顺行标识表记标帜。 B.视神经挤压手术的设置。工做场合以及仪器该当是无菌的。 C.玻璃体内打针CTB的打针方案。将含有CTB的拉制玻璃毛细管以大约45°-50°的角度从头插入玻璃体中,而不会接触或损坏眼睛晶状体。 D.毁伤后21天视神经的共聚焦图像,显示一些CTB阳性再生轴突穿过病变部位(红色虚线)。的比例示出了能够计较再生轴突的示例性距离,而且除以该距离处的视神经的宽度,以揣度视神经的每个宽度的再生轴突的数量。比例尺=100μm。

  小胶质细胞存正在于中枢神经系统(CNS)中,并参取维持心理形态。他们不竭查询拜访他们的,以寻找取受伤或疾病相关的病理改变。几十年来,研究人员利用旨正在或消弭这些细胞的方式,研究了小胶质细胞正在分歧病理前提下的感化。然而,曲到比来,方式未能实现完全耗尽。此外,医治凡是会影响其他细胞,因而难以从这些研究中得出明白的结论。比来,我们曾经表白,通过用含有食物的PLX5622口服医治集落刺激因子1受体(CSF1R)可以或许完全消弭视网膜小胶质细胞而且几乎完全消弭视神经中的小胶质细胞,而不影响外周巨噬细胞或其他细胞。利用这种方式,我们研究了小胶质细胞正在视网膜神经中的感化以及正在分歧前提下受损视神经中的轴突再生。因而,这里提出的这种无效,靠得住和易于利用的方案将使研究人员可以或许明白地研究小胶质细胞对神经变性和轴突再生的贡献。该方案还能够容易地扩展到视觉系统中的急性和慢性毁伤或疾病的其他典范。

  将春秋正在6-10周之间的雄性和雌性小鼠连结正在12小光阴照/周期,随便随便获取食物和水。&

  两天后,如前所述麻醉小鼠,并用冰凉的PFA溶液心内灌注小鼠(Hilla et al。,2017; Leibinger et al。,2017) 。

  处理小胶质细胞正在中枢神经系统退化和轴突再生中感化的合适模子是其视网膜神经节细胞(RGCs)的视觉通,其轴突通过视神经凸起(Leibinger et al。。,2009 ; Fischer和Leibinger,2012年)。轴突毁伤时,轴突凡是无法再生(Thanos,1991; Fischer et al。,2000)。急性毁伤后的退行性和再素性过程能够别离正在视网膜和视神经中容易地,如本方案中所示。此外,视觉系统,出格是RGC是研究慢性疾病(如多发性软化或青光眼)神经退行性过程的合适模子(Kerrison 等。,1994; Howell 等。,2007; Diekmann和Fischer,2013; Dietrich et al。,2018)。此外,视神经被普遍用做研究CNS中一般再生衰竭的典范模子和推进轴突发展的策略(Fischer和Leibinger,2012)。

  利用一对珠宝商的镊子悄悄拉出眼睛,以更好地进入眼球后概况。以45°-50°的角度进行眼部后入眼,以避免不测的镜片毁伤,并将玻璃毛细管插入玻璃体内(图1C)。打针后,敏捷将针头从眼球上取下。